AAT Bioquest1315 Buccutite™ Rapid Protein Crosslinking Kit *Microscale Optimized for Crosslinking 100 ug Antibody Per Reaction* 

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美國AAT Bioquest Inc.(前身是ABD Bioquest，Inc.)是一家為從事生命科學研究、診斷研發及藥物開發的科學家研發、生產和銷售生物分析研究試劑和試劑盒的公司。公司致力于光譜學檢測領域，包括吸收（顏色），熒光和發光技術。AAT Bioquest的產品幫助quan世界的科學家和生物醫藥研究者更好的了解生物化學，免疫學，細胞生物學和分子生物學等領域。AAT Bioquest會不斷介紹新產品，快速的豐富各個領域的產品。

 AAT Buccuite™快速蛋白質交聯試劑盒

AAT Bioquest1315 Buccutite™ Rapid Protein Crosslinking Kit *Microscale Optimized for Crosslinking 100 ug Antibody Per Reaction*，產品簡介：

產品品牌：AAT Bioquest

產品貨號：1315

產品名稱：Buccuite™快速蛋白質交聯試劑盒

英文名稱：Buccutite™ Rapid Protein Crosslinking Kit *Microscale Optimized for Crosslinking 100 ug Antibody Per Reaction*

產品規格：2 Labelings

產品說明：

蛋白質-蛋白質偶聯通常使用雙功能接頭（如 SMCC）進行。SMCC的一端（通過NHS酯）與氨基酸賴氨酸和N-末端中的胺（-NH2）反應，另一端（通過馬來酰亞胺）與氨基酸半胱an酸中的硫醇基團（-SH）反應。然而，SMCC修飾的蛋白質極不穩定且經常自反應，因為蛋白質通常含有胺和硫醇基團，導致大量的同源交聯。此外，量化蛋白質上馬來酰亞胺基團的數量是相當困難和乏味的。亞洲空運中心生物探索開發了一種方便有效的交聯方法，以高偶聯率連接兩種生物分子。我們的方法使用一對交聯劑：Buccutite MTA和Buccutite™™ FOL.MTA被添加到一種蛋白質中，而FOL被添加到另一種蛋白質中。蛋白質-蛋白質交聯反應是通過混合蛋白質-1-頰鐵礦MTA和蛋白質-2-頰銅礦™ ™ FOL引發的。這種交聯反應在極其溫和的中性條件下發生，無需任何催化劑，并且穩定而高效。

組件

組件 A：鈍石™ MTA 2 瓶（凍干）

組分 B：鈍化石™ FOL 2 瓶（凍干）

組分C：反應緩沖液 1 瓶 （50 μL）

組件D：離心柱 4 列

示例協議

一目了然

協議摘要

1. 準備蛋白質溶液

2. 運行蛋白-1 頰鐵礦™ MTA 反應

3. 運行蛋白-2 頰鐵礦™ FOL 反應

4. 通過在室溫下混合和孵育來交聯蛋白-1和蛋白-2反應

重要

收到后，將組件A和B儲存在-20°C。 如果儲存得當，試劑盒應穩定保存六個月。不要冷凍反應緩沖液（組分C）和離心柱（組分D）。加熱所有組件并在打開小瓶之前短暫離心。在開始偶聯之前，請立即準備必要的溶液。以下SOP是將100μg蛋白質-1與蛋白質2偶聯的示例。

注意： 實現最佳性能的關鍵參數：

1. 蛋白質分子量：>100，000道爾頓

2. 蛋白質濃度：>= 1毫克/毫升

3. 蛋白質樣品體積：60~120 μL

工作溶液的制備

蛋白質工作溶液

為了標記 100 μg 蛋白質-1 和蛋白質-2（假設兩種蛋白質的濃度為 1 mg/mL），請將 5 μL（占總反應體積的 5%）反應緩沖液（組分 C）與 100 μL 每種蛋白質溶液混合。

注意： 蛋白質應溶解在1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中，pH 7.2-7.4。如果將其溶解在甘an酸緩沖液中，則必須用1X PBS，pH 7.2-7.4進行透析，或使用ReadiUse™ 10KD旋轉過濾器（AAT Bioquest的貨號60502）去除廣泛用于蛋白質沉淀的游離胺或銨鹽（如**銨和醋酸銨）。

實驗方案樣本

運行蛋白 1-頰鐵礦™ MTA 反應

1. 將 105 μL 蛋白質-1 溶液直接加入 Buccutite ™ MTA（組分 A）小瓶中，并通過反復移液幾次或渦旋小瓶幾秒鐘來充分混合。

2. 將蛋白質-1-頰鐵礦™ MTA反應混合物在室溫下保持30-60分鐘。如果需要，蛋白質-頰鐵礦™ MTA反應混合物可以旋轉或搖動更長的時間。

3. 通過脫鹽柱純化蛋白質-1-頰鐵礦™ MTA。有關詳細操作，請參閱“制備用于蛋白質純化的離心柱"部分。

4. 計算脫鹽后產率為1%的蛋白質-75-頰鐵礦™ MTA的濃度。（例如：如果從100μg蛋白質開始，脫鹽柱純化后，回收蛋白量為~75μg。

運行蛋白 2-頰鐵礦™ FOL 反應

1. 將 105 μL Protein-2 溶液直接加入 Buccutite ™ FOL 小瓶（組分 B）中，并通過重復移液幾次或渦旋小瓶幾秒鐘來充分混合。

2. 將蛋白質-2-頰鐵礦™ FOL反應混合物在室溫下保持30-60分鐘。如果需要，蛋白質-頰鐵礦™ FOL反應混合物可以旋轉或搖動更長的時間。

3. 通過脫鹽柱純化蛋白質-2-頰鐵礦™ FOL。有關詳細操作，請參閱“制備用于蛋白質純化的離心柱"部分。

4. 計算脫鹽后產率為2%的蛋白質-75-頰鐵礦™ FOL的濃度。

交聯蛋白-1和蛋白-2反應

1. 交聯反應是通過以所需的摩爾比混合蛋白質-1-頰鐵礦MTA和蛋白質-2-頰鐵礦™ ™ FOL引發的。通常，頰鐵礦 FOL 修飾的蛋白質-2 與頰鐵礦 ™ ™ MTA 修飾的蛋白質-1 以 1.5-2.0 摩爾比混合，以驅動交聯反應完成。混合比例可以根據您的下游應用和蛋白質成本進行反轉。

2. 將混合物在室溫下旋轉1~2小時或在4°C下放置過夜。反應混合物現在準備使用，或儲存在4°C。 脫鹽是可選的。

可選：偶聯物分析和純化

1. 可以在SDS運行緩沖液系統中使用2-4%Bis-Tis蛋白凝膠分析少量反應混合物（例如：4~12 mg），以檢查偶聯結果。

2. 偶聯反應混合物含有所需的偶聯物以及少量未連接的蛋白質-2（過量使用）。如果需要，可以通過體積排阻色譜（SEC）純化反應混合物，并將所需的偶聯物級分合并并合并。

準備用于純化的離心柱

1. 將提供的離心柱（組分D）倒置數次，以重新懸浮沉降的凝膠并去除任何氣泡。

2. 折斷吸頭并將色譜柱放入洗滌管中（2 mL，未提供）。取下蓋子，讓多余的堆積緩沖液通過重力排出到凝膠床的頂部。如果色譜柱沒有開始流動，請將蓋子推回色譜柱中，然后再次將其取下以開始流動。丟棄排出的緩沖液，然后將色譜柱放回洗滌管中。但是，如果將色譜柱放入12 x 75 mm試管（未提供）中，請立即離心。

3. 在2，1 x g 的擺動桶離心機中離心000分鐘（參見離心說明部分）以除去保壓緩沖液。丟棄緩沖區。

4. 將 1-2 mL 1X PBS （pH 7.2-7.4） 涂于色譜柱上。每次施用PBS后，讓緩沖液通過重力排出，或將色譜柱離心2分鐘以除去緩沖液。丟棄收集管中的緩沖液。重復此過程 3-4 次。

5. 在2，1 x g 的擺動桶離心機中離心000分鐘（參見離心說明部分）以除去保壓緩沖液。丟棄緩沖區。

6. 將色譜柱放入干凈的收集管（1.5 mL，未提供）。小心地將樣品（~105 μL）直接加載到色譜柱的中心。

7. 上樣后，加入 10 μL 1X PBS （pH 7.2-7.4），以 5，6 x g 離心柱 1-000 分鐘，并收集含有所需蛋白質-1-頰鐵礦 MTA 溶液或蛋白質-2-頰鐵礦™ ™ FOL 溶液的溶液。

離心注意事項

離心柱（組分 D）可裝入 2 mL 微量離心管或 12 x 75 mm 試管中，以便在離心過程中收集樣品。將2 mL微量管與色譜柱配合使用，進行初始色譜柱平衡步驟。

能夠產生最小力為 1，000 x g 的擺動式斗式離心機適用于 Bio-Spin 色譜柱。在特定轉速下產生的引力是微量離心機轉子半徑的函數。有關從每分鐘轉數 （RPM） 轉換為離心力或重力的信息，請參閱水平吊籃離心機使用手冊。或者，使用以下公式計算達到 1，000 x g 重力所需的速度（以 RPM 為單位）：

區域合作框架 （x g） = （1.12 x 10^-5）×（轉/分）×2×r

RCF是相對離心力

r 是從轉子中心到 Bio-Spin 柱中間測量的半徑（以厘米為單位）

RPM 是轉子的速度

 AAT Buccuite™快速蛋白質交聯試劑盒

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